【文档说明】专题5 课题3 血红蛋白的提取和分离（讲义）-2020-2021学年高二生物下学期教学设计（人教版选修1）.docx，共(11)页，237.917 KB，由管理员店铺上传

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1血红蛋白的提取和分离【学习目标】1、掌握蛋白质分离的方法凝胶色谱法的原理、缓冲液的制备及作用和蛋白质纯度鉴定的方法电泳法的原理。2、掌握蛋白质提取和分离的过程。3、掌握蛋白质分离过程中需注意的问题。一、蛋白质分离技术1、蛋白质特性的差异(1)分子的形状和大小；(2)所带电荷

的性质和多少；(3)溶解度；(4)吸附性质；(5)对其他分子的亲和力。2、分离蛋白质的方法(1)凝胶色谱法2①概念：凝胶色谱法，也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。②凝胶：微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构成，内含许多贯穿通道,如葡聚糖或琼脂糖。具有多孔的凝胶又

称为分子筛。③凝胶色谱法分离蛋白质的原理(如图A)相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内部的通道，

通过的路程较长，移动速度较慢，因此可将各种相对分子质量不同的蛋白质分离。相对分子质量直径大小运动方式运动速度运动路程洗脱次序大大于凝胶颗粒空隙直径、垂直向下移动较快较短先从凝胶柱洗3被排阻在凝胶颗粒的外面脱出来小小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入凝胶颗粒内

部垂直向下移动，无规则扩散进入凝胶颗粒较慢较长后从凝胶柱洗脱出来④分离蛋白质的过程(如图B)蛋白质混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→先收集大分子→后收集小分子。a.蛋白质混合物上柱；b.洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；

相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外；c.相对分子质量较小的蛋白质被滞留；相对分子质量较大的蛋白质向下移动；d.相对分子质量不同的蛋白质分子完全分开；e.相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分

子质量较小的蛋白质还在行进中。(2)电泳4①概念：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。②原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。在同一电场下，由于各种分子

带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。③常用方法a.琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子带电性质的差异、

分子大小和形状的不同而不同，从而得以分离。b.聚丙烯酰胺凝胶电泳加入SDS作用：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链；SDS能与各种蛋白质结合形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷

量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。(3)缓冲溶液①概念：在一定范围内，能够抵制外界的酸、碱或稀释的影响，维持pH基本不变的溶液叫做缓冲溶液。5②缓冲溶液的配制：缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例

就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。小贴士缓冲溶液常见的有三类1弱酸及其对应盐，如CH3COOH—CH3COONa，H2CO3—NaHCO3。2多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐，如：NaHCO3—Na2CO3

，NaH2PO4—Na2HPO4。3弱碱及其对应盐，如NH3·H2O—NH4Cl。二、血红蛋白的提取和分离血红蛋白由四条肽链组成，包括两条α-肽链和两条β-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可以携带一分子氧和

一分子二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈红色。每一种蛋白质的分离纯化方法因其来源和性质不同会有很大差异，以哺乳动物红细胞为材料，蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。（一)样品处理及粗分离1、红细胞的洗涤

（1）目的：去除杂蛋白；（2）方法：采集血样，低速短时间离心，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入6烧杯，再加入五倍体积的生理盐水稀释，再离心，重复三次，直至上清液中不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。简述如下图：2、血红蛋白的释放（1）

目的：使红细胞破裂释放血红蛋白。（2）过程：①将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，其作用是使红细胞吸水涨破；②加入40%体积的甲苯，其作用是溶解细胞膜；③置于磁力搅拌器上充分搅拌10min，其作用是加速红细胞破裂；④红细胞破裂，

释放出血红蛋白。简述如下图：3、分离血红蛋白溶液过程：将混合液离心→将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶沉淀层→于分液漏斗中静置片刻→分离出下层的红色透明液体。7（1）将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10m

in，试管中的溶液分为4层：（2）将试管中的液体用滤纸过滤、除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的红色透明液体，即血红蛋白溶液。4、透析（1）原理：透析袋是用硝酸纤维素（又称玻璃纸）制成，能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。（2）过程：取1mL的血红蛋白溶液装入透析

袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。（3）目的：a.除去样品中相对分子质量较小的杂质。b.用于更换样品的缓冲液。（二）纯化——凝胶色谱操作1、凝胶色谱柱

的制作(1)取长40cm，内径为1.6cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。(2)柱底部制作：橡皮塞打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱将橡皮塞上部包好。8(3)柱顶部制作：打孔→安装玻璃

管。(4)组装：将上述三部分按相应位置组装成一个整体。2、凝胶色谱柱的装填(1)计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量(2)凝胶溶胀：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液(3)固定：将色谱柱垂直固定在支架上(4)装填：将凝胶悬液一次性装填入色谱柱内(5)洗涤平衡：用20mmol/L的磷酸缓冲

液(pH＝7.0)洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密3、样品的加入和洗脱（1）调整缓冲液面：与凝胶面平齐（2）滴加透析样品：用量为1mL（3）样品渗入凝胶床：样品完全进入凝胶层（4）洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱（5）收集：待红色的蛋白质

接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集（三）纯度鉴定——电泳判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。三、实验注意事项91、红细胞的洗涤（1）洗涤红细胞时不能用蒸馏水代

替生理盐水。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂，在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。（2）离心速度与离心时间十分重要，离心转速要低，时间要短。如果离心速度过高和时间过高会使白细胞

和淋巴细胞一同沉淀，达不到分离的效果。（3）洗涤红细胞时，洗涤次数过少，无法去除血浆蛋白；一般重复洗涤三次，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数。（4）在血红蛋白释放过程中，加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。细胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机溶剂，加

入甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红蛋白。2、色谱柱填料的处理商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需要放在洗脱液中膨胀，为了加速干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，通常只需1～2h。这种方法不仅节约时间，还可除去凝胶中可能带有的微生物，排出胶粒内的空气。3

、凝胶色谱柱的装填在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。在凝10胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生

上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。4、蛋白质的分离滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，不要破坏凝胶面。根据红色区带的移动状况判断收集流出液的时间。分离蛋白质时，要求各种蛋白质同时从相同起点开始分离，在凝胶色谱操作中加样时要保证分离样品进入凝胶层后再接通洗脱液，开

始洗脱。在电泳操作中，通过浓缩胶的作用，将样品浓缩后再进入分离胶分离。血红蛋白呈现红色，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断收集洗脱液的时机。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。四、课堂成果评价1、样品处理、分离与纯化的目的目的红细胞洗涤去除杂质，如血浆蛋白血红蛋白释放

使红细胞破裂，释放血红蛋白分离血红蛋白溶液经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开透析除去样品中相对分子质量较小的杂质纯化除去相对分子质量较大的蛋白质112、对血液样品处理后样品发生的变化的分析①正常现象：由于血红蛋白与氧气结合呈鲜红色，与二氧化碳结合呈暗红

色，所以刚分离的血红蛋白溶液呈红色。②分层不明显的原因：洗涤次数少，未完全除去血浆蛋白。③红细胞不纯净的原因：离心速度过高或时间过长，使白细胞和淋巴细胞一同沉淀而造成。3、判断装填的凝胶色谱柱成功与否①判断方法：a．在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填均匀。b．加入大分子的

有色物质，观察色带移动情况。②成功的标准及调整：判断标准：若色带均匀、狭窄、平整，说明性能良好。调整方法：若色谱柱内出现纹路或是气泡，可轻轻敲打柱体以消除气泡，若消除不了则重新装柱。4、对分离效果的判断①若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。②若血

红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则说明分离效果不好，装填不成功。