【文档说明】2024届高考一轮复习生物试题（苏教版）第十单元 解惑练4 PCR技术拓展应用 Word版.docx，共(5)页，643.794 KB，由小赞的店铺上传

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应用1：反向PCR测定未知DNA区域当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理：用限制性内切核酸酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以

该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。应用2：PCR定点突变技术该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用

引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。应用3：(实时)荧

光定量PCR(RT－PCR)先从样本中提取RNA，RNA中可能有新冠病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA。通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA，并进行PCR扩增，在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探

针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分

子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小(如图)。跟踪训练1．如图所示，在一段未知序列的突变体DNA片段中，插入了已知序列的T－DNA，要想对T－DNA两

侧的未知序列进行测序，下列做法正确的是()A．用引物①和引物④直接进行PCR扩增之后再测序B．用引物②和引物③直接进行PCR扩增之后再测序C．用DNA连接酶连接成环状后，再用引物①④PCR扩增后测序D．用DNA连接酶连接成环状后，再用引物②③PCR扩增后测序2．重

叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定

点突变，原理如图。下列说法错误的是()A．过程②需要含Mg2＋的缓冲液、DNA模板、引物、4种脱氧核苷三磷酸、热稳定的DNA聚合酶等B．若引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次DNA分子的

复制后，一共会产生2种DNA分子C．经过程④获得的杂交DNA有2种，其中只有一种可以经过程⑤获得目的基因D．过程⑤使用热稳定的DNA聚合酶延伸，不需要引物3．(2023·江苏泗洪县高三检测)基因定点突变是指按照特定的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换、重排等变异。下图甲

是一种PCR介导的基因定点突变示意图，图乙是研究人员利用基因M1构建基因表达载体的过程。请回答下列问题：(1)进行基因定点突变的PCR反应体系中，除加入引物和模板DNA外，一般还需要加入______________________________；图甲所示的基因定点突变技术需要______

__次PCR；获得产物A需要的引物是____________。(2)研究人员对PCR的中间产物A、B进行纯化后，利用图中相关酶对基因M和产物A、B进行充分酶切后得到不同的片段，长度(kb)如下表，则图中基因敲除片段的长度为___

___________，基因M1的长度为____________。项目基因MAB长度3.24、2.8、0.15、0.132.8、0.093.24、0.05(3)通过图甲过程获得的基因M1仍需要大量扩增，此时选择的引物是__________，为了与图乙中的Ti质粒相连，还需要分别

在它们的______端引入限制酶____________的识别序列。(4)构建基因表达载体时，M1基因必需插入到Ti质粒的______________中，原因是___________________________________________

_____________________________________________________________________________________________________。4．“实时荧光定量qP

CR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在1～2h内即可得到检测结果。Taqman探针是实时荧光定量RT—PCR技术中的一种常用探针(如图1)，其5′端连接荧光基团(R)，3′端连接淬灭剂(Q)。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过

程中，当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步(如图2)。请据图回答下列问题：(1)结合图1和图2分析，“荧光RT—PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有____________酶、____________

__酶、Taqman探针、引物、dNTP、Mg2＋、缓冲剂等。这种分子层面的荧光RT—PCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的____________、______________有关。(2)根据Taqman探针功能分析，探针

中碱基序列的设计应主要依据____________________。新冠病毒是冠状病毒大家庭中新的一员，其碱基序列与引起SARS的冠状病毒碱基序列有79.5%的相似性，与流感病毒碱基相似度也较高，因此在设计Taqma

n探针时应筛选出该病毒特有的序列，以避免__________(填“假阴性”或“假阳性”)的出现。(3)根据图1和图2，Taq酶除了能催化DNA子链的延伸，还能___________________。(4)若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值a，则反应体系中某时刻荧光信号强度(Rn)主要与__

____________、______________有关。在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，增加了检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才确诊。可通

过荧光强度的变化监测产生量的变化从而得到一条荧光扩增曲线图(如图3)。“平台期”出现的最可能的原因是试剂盒中________________等有限，超出一定的循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加。(5)

虽然荧光RT—PCR是当前被广泛认可的检测手段之一，但是不断有“假阴性”现象报道，通过上述过程分析，“假阴性”的可能原因有__________(填字母)。a．通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足b．在样本运输、检测中出现了损坏和污染c．病

毒相应关键序列发生了基因突变